《Adv. Sci.》活体自由基测量新范式——纳米金刚石量子传感在秀丽隐杆线虫中的突破

引言

本研究利用荧光纳米金刚石（FNDs）及其 T1 弛豫量子传感能力，在活体秀丽隐杆线虫中实现了多聚谷氨酰胺（PolyQ）亨廷顿病模型的自由基原位（在活体线虫肌肉或肠道直接测量）、直接、亚微米级检测，揭示了 PolyQ 聚集与局部自由基升高的显著相关性。

正文

一、研究背景

1. **亨廷顿病（Huntington's disease, HD）**由异常多聚谷氨酰胺（PolyQ）蛋白聚集引发，伴随自由基（ROS）水平升高，但其因果关系及局部空间分布尚不明确。

2. 自由基寿命短、扩散受限，传统 ROS 检测方法主要为间接测量，难以实现高空间分辨率与实时监测。

3. 荧光纳米金刚石（FNDs）内的氮-空位（NV）色心可通过磁噪声响应直接感知自由基，已在细胞水平验证，但尚未扩展到活体模式动物。

4. 秀丽隐杆线虫（C. elegans）Q40::YFP 模型可稳定模拟 PolyQ 聚集，适合进行体内氧化应激机制及空间分布研究。

二、实验方法与技术体系

1. 线虫模型构建

选用野生型 N2、sod-2/3 双突变氧化应激模型、Q0::YFP 对照及 Q40::YFP 亨廷顿病模型线虫

2. 纳米金刚石递送与分布

采用牛血清白蛋白（BSA）包覆荧光纳米金刚石（FNDs），通过饲喂方式进入线虫体内，可跨越肠道细胞分布至体壁肌肉等组织。

3. 量子传感检测

基于 FNDs 的 T1 弛豫测量，使用 650 nm 滤光片去除 YFP 干扰，对体壁肌肉与肠道区域分别进行自由基检测

4. 表型与活性验证

运动能力分析、ATP 含量测定、DHE 荧光 ROS 检测、FND 生物相容性评估

5. 数据处理

采用双指数拟合计算 T1 值，以非配对 t 检验、单因素方差分析进行统计学检验

三、关键研究结果

1.FNDs 生物相容性

FNDs 可通过饲喂进入线虫体内，分布至体壁肌肉与肠道
对线虫存活率与 ATP 水平无显著影响 → 生物相容性良好

2.方法验证：sod-2/3 双突变线虫

T1 弛豫测量结果：全身 T1 值显著降低
解释：自由基整体水平升高
结论：验证 T1 弛豫量子传感法可在活体动物中可靠检测自由基

3.PolyQ 聚集与自由基局部升高

Q40::YFP 线虫体壁肌肉区域 T1 值显著低于 Q0 对照组
说明 PolyQ 聚集部位自由基水平显著升高
结果呈现空间特异性：局部聚集区域自由基升高，而非全身均匀升高

四、纳米金刚石 T1 弛豫法技术优势

该技术依托 NV 色心对磁噪声的直接响应，可原位检测自由基未配对电子，无需间接标记，具备亚微米空间分辨率。T1 信号可实时反映自由基浓度变化，不受 YFP 荧光干扰，能够区分不同组织、不同疾病模型的氧化应激差异，实现活体动物内自由基的精准定位与定量。

五、研究结论与意义

本研究首次将纳米金刚石量子传感技术应用于活体动物，实现自由基原位、直接、亚微米级检测，揭示 PolyQ 聚集与局部氧化应激升高的空间特异性，为神经退行性疾病研究提供新工具，并具备拓展至其他模式动物的潜力。

1. 技术突破

首次实现纳米金刚石量子传感在活体秀丽隐杆线虫中对自由基的直接检测，突破传统间接测量限制

2.生物学发现

PolyQ 聚集可引发局部自由基特异性升高
明确了亨廷顿病模型中氧化应激的空间分布特征

3. 方法学贡献

建立了活体动物水平量子传感自由基检测流程
为神经退行性疾病中氧化应激机制研究提供了新的实验工具

4.应用前景

技术可拓展至多种模式动物
为量子传感在体内病理生理机制研究及药物评价提供潜力平台

图文导读

图1. 本文开展的实验

a) 本文中基于金刚石的量子传感示意图。纳米金刚石被秀丽隐杆线虫摄取并被细胞吸收。量子传感实验在纳米金刚石与 Q40:: YFP 共定位的表面附近进行。b) 第一天成虫野生型 N2 线虫和 sod-2/3 突变线虫中纳米金刚石的代表性弛豫曲线；c) 对照组 Q0 线虫及多聚谷氨酰胺（PolyQ）应激的 Q40 线虫。NV 色心被诱导进入明亮的 ms=0 状态。随后通过不同黑暗时间观察 NV 色心是否保持该状态或恢复至 ms=0 与 ms=±1 之间的暗态平衡。该过程会因自由基而加速。d)秀丽隐杆线虫固定于玻璃底培养皿的琼脂垫上进行测量。e) 将培养皿置于实验装置上。

图2. 第1天成虫秀丽隐杆线虫中 polyQ 扩展的表达情况

a) Q0 代，b) Q40 代。秀丽隐杆线虫肌肉中 polyQ 扩展的表达会导致运动缺陷，具体表现为：c) 移动线虫占全部线虫的比例；d) 每条线虫每分钟的平均弯曲时间；e) 第1天成虫 Q0 代及多聚谷氨酰胺（polyQ）应激处理的 Q40 代线虫的 ATP 测定结果。误差条表示三次重复实验的标准偏差。统计学显著性通过 t 检验评估，*表示 p ≤0.05，**表示 p ≤0.01。

图3. FND /BSA 颗粒在以下线虫中的分布：

a) N2 野生型及 GA480（ sod2/3 双突变体）线虫；b) OW450 Q0:: YFP 线虫；c) AM141 Q40:: YFP 线虫。放大图片中线虫边界以虚线标示，放大图显示了左图中红色方框所标区域。

图4. 通过细胞滴度测定法评估 ATP 水平，针对不同线虫重复三次实验：

a) N2 野生型；b) GA480（sod2/3双突变体）线虫；c) OW450 Q0:: YFP 线虫；d) AM141 Q40:: YFP 线虫，分别与 FND、FND /BSA 或 50%乙醇（阳性对照）共同孵育。各图中数据均通过将对照组均值定义为 100%、0设为0%进行标准化。误差线表示标准偏差。统计学显著性采用单因素方差分析评估，结果标注为：ns（不显著）p >0.05；*表示 p ≤0.05；**表示 p ≤0.01；***表示 p ≤0.001。

图5. 通过 DHE 检测法测定的不同第1天成虫秀丽隐杆线虫品系中 ROS 水平

a) DHE 通道的共聚焦图像。可观察到突变线虫的红色荧光增强。图(a)中第1天成虫线虫的平均 DHE 荧光强度通过 FIJI 软件进行量化。b) N2 与 sod2/3 突变线虫的比较。c) Q0 与 Q40 线虫的比较。须状图表示最低和最高数据点；分割箱体的线条代表中位数，箱体上下边缘分别代表最高和最低四分位数。每次实验分析10条线虫，共进行三次独立实验。各组数据通过将对照组均值定义为 100%、0 设为 0% 进行标准化，随后采用非配对 t 检验进行分析。****表示 p ≤0.0001。

图6. 不同蠕虫品系中通过 T1 弛豫测量法检测自由基的情况，数据来源于多次独立实验，每组约进行30次测量

a) Q40 蠕虫中 FND /BSA 的代表性荧光图像，白色虚线为体壁边界，底部强度条以光子计数/秒表示。a1) a)图中肠道颗粒的放大图像（黄色十字标记位置），光子计数为 1.2×10⁷ 次/秒−1。a2) a)图中靠近体壁肌肉层的颗粒放大图像，光子计数为 1×10⁷ 次/秒−1。图中展示了 N2、sod2/3 双突变蠕虫、Q0 和 Q40 蠕虫体内 FND /BSA 颗粒在 b)体壁肌肉附近及 c)肠道内的 T1 弛豫测量结果。为区分蠕虫不同部位的自由基水平，对同一蠕虫的肠道或体壁肌肉层 FND /BSA 颗粒进行了测量。虚线表示单个蠕虫的独立测量值：d) Q0 蠕虫；e) Q40 蠕虫。在(b)和(c)图中，须线代表最低和最高数据点，分割箱体的线条表示中位数。标准差列于表 S2（支持信息）中。箱体上下边缘分别代表最高和最低四分位数。组间显著性通过非配对 t 检验进行分析。*表示 p ≤0.05，****表示 p ≤0.0001。在(d)和(e)中，误差线代表三次独立实验（共测量30条线虫）的标准差。组间显著性通过配对t检验进行分析。ns = 无显著差异；*表示 p ≤0.05，**表示 p ≤0.01，***表示 p ≤0.001，****表示 p ≤0.0001。

结语

原文链接：
https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202412300