《Acta Biomater.》告别荧光探针干扰：NV 色心纳米金刚石量子传感开启巨噬细胞自由基时空动态监测新范式

引言

2025年1月发表于生物材料领域顶级期刊 Acta Biomaterialia “Quantum sensing to monitor changes in free radical generation by intracellular vesicles of polarized macrophages”（利用量子传感监测极化巨噬细胞胞内囊泡自由基生成变化）

技术标签：非染料（Non-dye）、无损（Non-destructive）、活细胞（Live-cell）、长时程时空动态监测（Long-term monitoring）。

改为该研究由荷兰格罗宁根大学 Romana Schirhagl 教授团队主导完成：利用固态自旋量子感知机制，将含 NV 色心（Nitrogen-Vacancy center）的荧光纳米金刚石（FNDs）引入巨噬细胞胞内内吞囊泡中，通过无损测量自旋纵向弛豫时间（T1）的动态变化，实现了在亚细胞尺度下对免疫细胞内源性自由基生成动力学的实时量化监测。该研究展示了固态自旋量子传感技术在复杂活细胞微环境中实现原位动态感知的可行性，为解析免疫微环境中的氧化应激过程提供了新的技术路径。

正文

一、引言：生命科学微环境研究的底层痛点

活性氧及自由基（ROS，如超氧阴离子 •O₂⁻、羟基 •OH 自由基等）是细胞代谢、免疫调控、炎症反应以及肿瘤微环境演进中的核心信号分子。以巨噬细胞（Macrophages）为例，在其吞噬病原体、清除细胞碎片及调控炎症的过程中，其胞内囊泡（内吞体/吞噬体，Vesicles/Phagosomes）会爆发式产生大量自由基，用以执行杀菌与信号传导功能。

然而，长期以来，生命科学领域始终缺乏一种能够在活细胞、亚细胞尺度下进行无损、长时程动态监测的低扰动检测方法。如何原位获取高时空分辨率的内源性分子通量数据，是解析细胞应激机理与免疫稳态的长期技术瓶颈。

二、传统检测手段的方法学局限

目前，生物医学界评估胞内自由基主要依赖小分子荧光染料或基因编码探针，但常规手段在面对复杂生物体系的长时程研究时，存在难以调和的方法学缺陷：

生化消耗与生理干扰：传统探针通常依赖与自由基发生氧化还原反应来显色，这意味着测量行为本身就在持续消耗目标分子，从而人为干扰了细胞原有的氧化还原平衡与原生生理过程。

光漂白与光毒性：连续高频的激发光照射会导致染料快速褪色（光漂白），且其光化学副产物具有显著的细胞毒性，彻底限制了长时程、连续动态监测的实现。

核心 ROS 检测方法学多维对比

针对复杂的胞内微环境检测，现有主流技术路线各存局限：

检测方法	核心机理	主要技术局限
荧光染料	化学反应显色	极易光漂白、具细胞毒性、无法进行长时程动态监测
电子自旋共振 (ESR/EPR)	顺磁共振波谱	空间分辨率不足，难以实现单细胞/亚细胞定位
电化学微电极	界面电荷转移	无法深入细胞器/胞内囊泡内部进行原位无损无损探测

三、NV 色心量子传感的物理核心思想

为了打破化学探针的底层瓶颈，本研究引入了固态自旋量子传感器。其核心物理思想基于材料的固有物理特性，实现了由“化学反应检测”向“物理场感知”的范式转变：

自旋微环境感知机理：具有未配对电子的自由基分子本质上是微观磁噪声源。而固态纳米金刚石（FNDs）内部的氮-空位（NV）色心，是一种对局域磁噪声变化极其敏感的固态自旋量子探针。

无损 T1 弛豫调制：当金刚石经由细胞自发内吞进入囊泡后，局域微环境中的自由基浓度波动会引发顺磁噪声的剧烈变化，并直接调制NV 色心的自旋纵向弛豫时间（T1）。通过非破坏性的光学测定，即可将这一自旋物理信号精准反推，实现对局域自由基生成动力学的非破坏性量化表征。整个感知过程基于纯物理交互，由于 NV-FNDs 具备极高的化学惰性，它在测量过程中不消耗目标自由基分子，最大程度降低了对原生生物学过程的扰动。

四、论文的核心方法学突破与实验验证

该研究团队在高度复杂的原代巨噬细胞体系中跑通了全流程验证，在实验方法学上实现了“纳米级空间定位”与“免疫表型解析”的跨界交融：

1. 亚细胞“胞内囊泡尺度”的局域微环境感知

借助表面羧基化 NV-FNDs 的天然内吞效应，量子探针被精准定植于巨噬细胞内部的内吞囊泡中。其探测半径被成功压缩至亚50 纳米尺度，跨越了传统光学成像的衍射极限，获得了真正具备细胞器级（Subcellular resolution）的局域动态信息。

2. “巨噬细胞极化”免疫应激流的动态解析

实验通过标准细胞因子诱导，构建了明确的免疫表型对照体系，借以评估不同极化状态下胞内囊泡自由基的生成动力学差异：

细胞模型	免疫表型定位	预期 ROS /自由基特征
M0 型	未激活静息态	维持基线低水平代谢释放
M1 型	经典激活（促炎型）	自发/应激诱导高水平 ROS 爆发
M2 型	替代激活（抗炎/修复型）	侧重组织重构，维持较低自由基水平

3. 关键实验结果表征

功能状态的量子分型：实验结果显示，在接受脂多糖（LPS）促炎激惹后，M1 型巨噬细胞内部的 T1 弛豫时间发生显著缩短，定量证实其囊泡内自由基生成速率和峰值远超 M0 与 M2 型。这表明 NV-FNDs 平台不仅实现了对 ROS 生成动力学的精确量化表征，更能精准映射出免疫细胞在不同应激状态下的功能表型。

外源性氧化应激的时空跨度追踪：在连续数小时的加药激惹实验中，系统完整、不间断地记录了外源性过氧化氢（H2O2）由外而内穿透细胞膜、诱导囊泡产生自由基演化并最终消散的完整时间轴动力学曲线。

断代级性能对标：

评估指标	传统荧光染料	NV 固态自旋量子传感
抗光漂白特性	显著褪色，基线持续漂移	极低漂移，支持高频不间断重测
长时程监测窗口	局限于数分钟至半小时的终点检测	可跨越数小时乃至更长生理周期
活细胞生物兼容性	具化学毒性，改变原有生化平衡	极佳，材料具化学惰性，零生化消耗
时空动态解析力	有限（多为时间积分的累积信号）	极强（具备亚 50nm 空间与实时间分辨）
亚细胞结构定位	较弱（多为全细胞弥散信号）	极强（精准锚定于胞内内吞囊泡内部）

五、学术范式的升维与展望

该工作的重要意义并不仅仅在于“检测了某一种自由基”，且建立了“ NV 色心纳米金刚石 → 胞内囊泡定位 → 局域磁噪声感知 → 自由基动态解析”的完整技术路径。其真正价值在于将量子传感首次系统性地引入复杂生命微环境研究之中。

通过将量子力学测量（T1 弛豫调制）转化为一种标准化的活细胞分析 Assay（分析方法），该研究建立了一种全新的原位量子感知范式。这不仅为后续将该技术拓展至三维类器官芯片、复杂人类原代组织切片的病理微环境连续解构奠定了坚实的方法学基石，更为 AI for Science 时代获取高保真、原生无损、多阶时空动态生物学大数据提供了不可替代的硬件底层路径。

图文导读

图1. 巨噬细胞极化及荧光纳米金刚石（FND）处理的实验设计示意图。

(a)巨噬细胞摄取荧光纳米金刚石，进而极化为 M1、M2 表型的全过程概述。(b) 采用流式细胞术结合标志物定量检测并评价巨噬细胞极化状态。(c) 利用共聚焦成像与共定位分析，观察荧光纳米金刚石在巨噬细胞内吞囊泡、早期内体（早期内体抗原1，浅红色）及晚期内体 / 溶酶体（溶酶体相关膜蛋白 1，浅蓝色）中的分布与相互作用。(d) 通过纵向弛豫时间（T1）弛豫测定法检测极化巨噬细胞的自由基浓度，解析细胞局部微环境特征。

图2. 无荧光纳米金刚石处理的细胞经刺激物作用 4 h、24 h、48 h 后，M1 型（a、b 图）与 M2 型（c、d 图）活化标志物的流式细胞术分析结果。图中展示各组的中位荧光强度（MFI）。红色星号表示与同时长 M0 型巨噬细胞组相比存在统计学显著差异，仅标注与 M0 组相比具有统计学意义的差异项。

图3. 经 70 nm 荧光纳米金刚石处理后，细胞受刺激物作用 4 h、24 h、48 h，M1 型（a、b 图）与 M2 型（c、d 图）活化标志物的流式细胞术分析结果，用于评估荧光纳米金刚石对巨噬细胞极化及标志物表达的影响。图中展示各组的中位荧光强度（MFI）。红色星号表示与同时长 M0 型巨噬细胞组相比存在统计学显著差异。